多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM

                多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM

                —— 一款全自动高精度单细胞操纵平台


                瑞士Cytosurge公司推出的多功能单细胞显微操作系统——FluidFM OMNIUM,是一款将原子力系统、显微成像系统、微流控系统、活细胞培养系统融为一体的单细胞显微操作平台,其核心技术——FluidFM技术采用了纳米级中空探针,轻松实现单个细胞水平、fL级别超高精度、全自动化的细胞操作。

                FluidFM技术打开了传统细胞实验手段无法触及领域的大门,突破了单细胞研究、药物开发、细胞系开发中的障碍,主要功能包括单细胞提取、单细胞分离、单细胞注射、单细胞力谱等。深度应用于CRISPR基因组编辑、单克隆细胞系开发、病毒学、神经科学和生物力学等领域。


                原子力与微流控技术的完美结合,能够实现对单细胞可视化、全自动、高速度、低伤害的操纵,可用于单细胞注射、单细胞提取、单细胞分选、单细胞粘附力的测定

                  单细胞提取

                ——FluidFM技术是极微量、低创、精准的活细胞原位提取方案


                直接细胞自然生长环境中提取单个细胞的内容物,同时不影响细胞活力。该程序是破坏性极低的,实验证明,可以在不同时间点对同一单个细胞进行细胞活组织检查。














                  单细胞分离

                ——FluidFM技术是进行无损细胞分离、分选、构建细胞系的理想工具


                直观、简单、温和、自动化;

                精确的挑选和放置细胞:选择你想要的细胞,并把它放在您需要的位置

                分离通量:约50个细胞/小时。



                可以将分离后的细胞放置任何您需要的位置,也可以按照不同的形状位置去放置细胞。



                  单细胞注射

                ——FluidFM技术是将多种不同类型物质精准注射入单细胞的最佳选择


                无损注入的将不同类型的物质准确注入到细胞质或者细胞核。
                可定量的fL级别注射。
                注射后细胞存活率>95%。

                每小时可注射>100个细胞。

                注射细胞种类:

                贴壁、悬浮细胞均可,对于注射细胞的种类,FluidFM并没有限制,而且,心肌细胞这种注射难度极高的细胞也能够胜任。

                注射任何可溶性化合物:

                Lucifer Yellow、UHRF1-BFP proteins、Small RNAs、Plasmids、CRISPR/Cas9 RNP complexes、Antibodies等。




                  单细胞力谱

                ——FluidFM技术在单细胞水平上提供高质量的力学数据


                细胞水平力学测定通量高、直接抓取或者压细胞即可。

                适用细胞种类:悬浮细胞、贴壁细胞均可测量

                力学范围:nN到μN级别的细胞水平的力

                操作简单:区别于AFM细胞力学测量,具有简便、直接的优势。


                  

                 


                应用

                FluidFM技术采用了纳米级中空探针,轻松实现单个细胞水平、fL级别超高精度、全自动化的细胞操作,打开了传统细胞实验手段无法触及领域的大门,突破了单细胞研究、药物开发、细胞系开发中的障碍,广泛应用于以下5个研究方向:1. 活细胞单细胞测序Live-Seq;2. 单细胞基因编辑CRISPR;3. 细胞系构建;4. 神经科学;5. 单细胞力谱等。

                活细胞单细胞测序

                Live-Seq

                单细胞基因编辑

                CRISPR

                细胞系构建

                神经科学

                单细胞力谱


                ■  活细胞单细胞测序Live-Seq


                科学家借助FluidFM技术对现有的scRNA-Seq单细胞测序方法进行优化,实现了Live-Seq。为了尽可能接近Smart-Seq的测试条件,先将缓冲液吸入探针,然后再进行细胞提取操作。这样可以确保所提取的RNA能够第一时间与缓冲液混合,从而避免RNA的降解。通过这一方法,科学家成功实现了IBA细胞的测序,证明了这种方法的可行性。

                图1. Live-Seq技术。a. Live-Seq技术的示意图和代表图片,黑色箭头指代液面;b. IBA细胞测序的质量控制图(n=10)。


                为了进一步证实Live-Seq的有效性,该团队又对多种细胞系进行了测序,这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞(ASPCs)以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现,该方法能够区分上述细胞系,并且在特征基因检测中能够找到每种细胞所对应的特征基因,证明了Live-Seq方法的有效性。

                图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态

                a. 实验方法示意图,使用LPS和PBS对RAW细胞进行处理;b. 前500个高度易变基因的tSNE图;c. 前十的细胞型、细胞状态差别基因的热图;d. 小鼠基因图谱预测,使用前100个标记基因的团簇;e. Live-Seq对比scRNA-Seq的锚点分析,显示两者没有显著差异。


                Live-Seq技术的最大优势在于提取过程中大大降低了对细胞的破坏程度。通过提取前后细胞的测序对比可以发现,提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察发现细胞的形态基本没有改变,提取后多数细胞仍然能够正常分裂。

                Live-Seq是一种十分具有前景的单细胞测序新方法。得益于FluidFM技术的无损提取优势,Live-Seq技术除了能够实现传统的测序功能外,还降低了细胞的损伤,避免了现有单细胞测序手段的细胞裂解等过程,从而能够获得更原生和真实的测序信息,让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信FluidFM技术将为单细胞测序技术带来更多可能。


                参考文献:Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. G?belein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752; doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752.



                更多应用案例,请您致电 010-85120280 或 写信至 info@qd-china.com 获取。





                ■  单细胞基因编辑CRISPR


                著名遗传学家George Church是哈佛医学院的遗传学教授、Wyss研究所的创始人,在基因组编辑领域实现了多个关键性突破,George Church教授及其团队在哈佛医学院Wyss研究所的平台和Cytosurge公司之间进行合作,将FluidFM技术应用于CRISPR基因编辑。 



                Cytosurge的单细胞显微操作技术平台,其单细胞注射和单细胞分离功能本身不会伤害细胞,为我们提供了解决细胞活力问题的切入点,并帮助我们大幅扩展基于CRISPR系统的复合组份基因编辑的潜力。——CRISPR大牛George Church博士。

                “作为一家源自瑞士苏黎世联邦理工学院的科技公司,我们在研究战略方面与Wyss研究所有着相同的思维模式。作为一家公司,有机会进一步推动基因工程和CRISPR系统的边界是非常令人兴奋和激励的?!?——Cytosurge公司CEO, Pascal Behr博士。


                参考链接:

                https://wyss.harvard.edu/news/harvards-wyss-institute-joins-forces-with-cytosurge-to-improve-crispr-based-multiplexed-gene-editing/

                https://www.cytosurge.com/blog/press-release-13/post/harvard-s-wyss-institute-joins-forces-with-cytosurge-to-improve-crispr-based-multiplexed-gene-editing-40


                基于FluidFM技术进行单细胞注射实现的基因编辑具有下面的独特优势

                (1) 直达细胞核:FluidFM系列产品提供了一种高度自动化的温和注射手段,直接将外源物质导入细胞核中,确保已知的RNPs和修复模板完整地抵达它们的目标。并且FluidFM技术在提高转染效率的同时并不会降低细胞生存能力(>95%)。

                (2) 低脱靶效应:最佳的转染剂量可以带来最大的转染效率,也可以避免一定的脱靶效应。由于FluidFM纳米注射允许计算注射物的体积,因此它是研究剂量/响应关系的理想方法,从而有效地将脱靶效应降到最低水平。

                (3) 难转染细胞:无论您使用的是原代细胞、干细胞、神经元还是其他已知的难以转染的细胞类型,FluidFM都将可靠地注入任何类型的化合物。

                (4) 多编码物质一次性导入:FluidFM纳米注射器可以一次装载数百种不同的gRNA并将它们同时导入到一个单细胞的细胞中。

                (5) 提高HDR效率:直接将转染所需要的复合物同时注射入细胞核。确保这些成分的共存,增加发生HDR的机会。



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                ■  如何使用FluidFM技术在短时间内生成单克隆多敲除细胞系?


                首先,通过FluidFM技术将外源物注射到CHO细胞中,同时靶向几个不同基因的基因组位点,直接将gRNA/Cas9 RNP复合物导入细胞核。纳米注射后,记录每个转染细胞的位置,这样以便在注射24小时后使用FluidFM探针进一步分离成功转染的细胞。然后将这些细胞扩展成单克隆细胞系。接下来对细胞进行测序,以确定基因编辑是否成功。

                第1天:FluidFM技术进行单细胞注射转染

                通过FluidFM技术进行纳米注射,简单的点击鼠标即可完成对几十个CHO细胞的细胞核的精准注射,以大约5个细胞/分钟的速度自动完成荧光标记物与所有不同的gRNA/Cas9 RNP复合物共注射,以方便监测注射过程并识别最佳候选复合物。

                第2天:FluidFM 技术进行单细胞分离和分选

                FluidFM对细胞进行了注射转染24小时后,使用集成FluidFM系列操作软件(ARYA)可以再次精确的找到所有目标细胞。然后进行单细胞分离和分选,将目标单细胞采用FluidFM探针进行单分离,放入空的孔板中。从可视化角度可以确保细胞系的单克隆性。

                第3 - 14天:单克隆细胞的扩增和突变分析

                分离后培养克隆,并在3天和6天后监测其生长情况。90%以上的分离细胞发育成一个细胞群落。转染后14天,收集克隆并对目标基因进行测序分析。50%的克隆在靶向位点上显示突变。

                 

                结论

                结果表明,通过FluidFM技术对单个细胞进行注射,完成了多个gRNAs同时递送到选定的单个细胞中这一艰难的任务。采用FluidFM技术方法进行的CRISPR细胞编辑技术,可使同时共注入几十种gRNAs所获得的细胞系进一步扩增。此外,我们在这里证明了FluidFM技术的使用大大减少了多表型单克隆细胞系的开发时间,从数月减少到三周。


                展望

                FluidFM技术为单细胞基因工程领域带来了全新突破,有希望解决科学家目前面临的一些艰巨挑战,尤其是快速和有效地开发单克隆细胞系。传统方法完全适用于最常见的细胞系和基因工程策略,但当处理不常见的、罕见的或脆弱的、和已知难以转染的原代细胞类型,或者需要复杂的实验设计——例如CRISPR多基因编辑时,传统的方案就非常受限制。在这些特殊情况下,FluidFM技术可能是唯一可用的解决方案。


                参考链接:https://www.cytosurge.com/applications/crispr-cell-line-development/application-note




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                神经元的一个关键特征是神经元与神经元之间以及神经元与周围环境可以进行交流。然而,在单个细胞水平上分析和理解这些相互作用仍然是细胞神经生物学中的一个关键挑战。为了解决这些问题,细胞神经生物学家需要一种能够以可控的方式创建神经元网络的工具,并以温和而非破坏性的方式操纵敏感的神经元细胞。FluidFM技术结合了微流控和原子力显微镜的最佳特性并与不同的力控探头相结合,为单个神经元操作提供了一系列可能性。


                  控制轴突生长和神经网络设计


                FluidFM探针可以填充多种液体,并打印特殊结构,厚度可达0.5 μm至数个毫米。该技术开辟了神经科学研究的广泛应用,如细胞生长模式或探索趋化效应等。András Saftics等通过使用FluidFM打印细胞基质胶,使细胞在打印好的基质胶上粘附和生长,并呈特定图形。

                上述方法对神经科学领域特别意义?;?/span>精确打印的模式,FluidFM技术也被用于设计神经元网络和研究单个神经细胞间相互作用。Dermutz及其团队利用FluidFM原位模式能力,通过沿着PLL打印线引导神经突生长来连接两个微型大脑(下图)。


                ■  对神经元进行刺激—精确定位


                FluidFM技术整合了fL精度微流控和纳米精度的xyz轴位移台,同时具备激光精确感知探针位置能。这种准确性使得对细胞的定向刺激成为可能,如神经元网络中的单个节点,甚至单个神经元轴突的特定区域,而不需要复杂繁琐的探针包被准备工作。

                Aebersold等成功地使用FluidFM通过传递谷氨酸(一种神经递质)来刺激胚胎大鼠海马神经元的活动,同时通过荧光显微镜和微电极阵列记录了它们的诱导活性。 


                左图:在进行活体钙成像时接近神经元。右图:神经元被植入微电极阵列(MEA)。

                 

                ■  神经元注射转染


                除了刺激细胞外,经过优化的FluidFM纳米注射器也可以有效地将任何可溶性化合物直接注入细胞溶胶或细胞核。蛋白质、药物,甚至基因物质(如CRISPR-RNPs)都可以被注入细胞,注入量可定量。

                与其他苛刻的转染方法相比,FluidFM力反馈控制探针的插入不会影响细胞的活力,这使得FluidFM特别适合于敏感和难以转染细胞的基因操作,如神经元、干细胞或原代细胞。

                左图:使用FluidFM注射编码GFP的质粒24h后表达GFP的神经元(暨南大学,中国广州)。

                右图:注射后红色荧光葡聚糖在C57BL/6 C57小鼠海马神经元中扩散(北京大学,中国北京)。


                FluidFM自带ARYA操作软件记录每个细胞的坐标和相关操作。




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                一直以来,科学研究中都缺乏一种能够在不改变细胞性质的同时测量细胞整体粘附力的设备。FluidFM 技术的出现改变了这一状况。高精密的流体力探针能够在精准感知压力的同时通过内压而非蛋白结合的方式牢固地抓取细胞而不改变细胞性质,为单细胞粘附力测定提供新的可能。

                Cytosurge 推出的全新的FluidFM 技术给粘附力测量带来了新的希望。这种技术结合了前沿的原子力显微镜探测技术与微流体控制系统,能够直接通过使用中空的原子力探针将细胞通过负压粘附在探针表面,而不需要激活细胞的任何通路信号,为粘附力的测量带来了极大的优势。一方面,这种方法能够提供远比蛋白结合牢固多的粘附力,将细胞牢固地固定在探针上面,因此能够直接从基质上分离。而另一方面,由于没有生物处理,这种方法不会改变细胞表面的任何通路,从而能够得到接近细胞原生的数据。本文就如何使用FluidFM 测定细胞粘附力和近期应用案例进行总结。

                 

                FluidFM 技术如何测定细胞粘附力?为了阐述这个问题,本文引用Scientific Reports 在2017 年发表的文献中的方法进行阐述。


                众所周知,细胞在基质上进行单层培养时,吸附在基质表面时主要会产生两种不同类型的力,一种是细胞与基质之间的粘附力,另一种是细胞与细胞之间的粘附力。因此对于细胞粘附力来说,单个细胞的粘附力就是细胞与基质之间的作用力。而单层细胞的细胞粘附力则是细胞之间相互作用力和细胞基质与细胞之间作用力之和。如下图所示:

                因此只要同时测定单个细胞粘附力即可得到细胞与基质之间的相互作用力,而细胞间的相互作用力则可以通过同时测量单层细胞的细胞粘附力和单个细胞的粘附力做差即可得到,如下公式所示:

                Force cell-cell ≌ Force Monolayer – Force Indiv.cell

                以上即为粘附力的计算方法,为了能够测量粘附力Sancho 等使用FluidFM 技术,通过将探针靠近细胞直到探针与细胞接触,之后开始对探针腔内增加负压从而牢固的吸住细胞。当细胞固定后收回探针并记录这之间的力学变化,如下图所示:

                 

                从图中显示出当探针开始靠近细胞后,探针表面开始出现压力变化,如上图中的蓝色区域所示。当出现这种变化后就停止下降探针并开始施加负压。这时候由于腔内负压,探针和细胞之间的结合变得紧密,导致探针被细胞向下拉动,从而产生了上边右图白色区域的力学变化。随后随着探针上升,细胞给以探针的拉力随之增高,并逐渐达到临界,使得细胞脱离基质。这一过程的最大值即为细胞粘附力。


                FluidFM 测定细胞粘附力的应用:


                ■  来自北京大学口腔医院的研究团队采用多功能单细胞显微操作系统——FluidFM OMNIUM,完成了单个细胞的分离及单个细胞粘附力的测量。实验中FluidFM探针以3 μm/s靠近细胞,设定力为100 nN。当探针连接到设定点的细胞时,在探针中施加-650 mbar 的力,并保持5 s,以确保细胞被探针完全抓取。然后保持-650 mbar的压力,以1 μm/s的速度将探针抬高至100 μm的高度,从而将细胞从基板上完全分离。FluidFM系统完全记录了每个单细胞的Z轴高度和力距离曲线,并分析其粘附强度。每个条件下至少测量并获得20个力距离曲线。所有细胞粘附测量实验过程都是在 37 °C、在5% CO2细胞培养环境下进行。



                ■  Cohen 等使用FluidFM 技术对MCF7-MCF10A、MCF7-HS5 的细胞粘附力进行了测定,并与以往的文献进行对比,发现其数据与Hossein 等测定的结果相符。如下图所示:


                 

                使用FluidFM 技术对MCF7-MCF10A、MCF7-HS5 细胞粘附力进行测定 a. 使用FluidFM 测定细胞粘附力全过程;b. MCF7-HS5 的细胞粘附力测试结果;c. MCF7-MCF10A 的细胞粘附力测试结果。


                ■  aatinen等通过使用FluidFM技术研究了外加电流对C2C12 小鼠成肌细胞粘附力的影响,发现随着外周电流的增加,细胞形态发生改变,与基质接触面积降低。当电流剂量高过11As/m2后细胞形态急剧改变,粘附力等参数发生明显变化,甚至死亡。如下图所示:


                FluidFM 测定C2C12 细胞粘附力 a.使用FluidFM 测定粘附力显微镜图;b.施加12.3As/m2电流和空白对照组的粘附力谱线;c.粘附力与电流之间的量效关系图。

                 

                ■  Sankaran等使用FluidFM技术来研究共价和非共价的表面整合素受体对细胞粘附力的影响。通过测定发现两者均可有效增加细胞的粘附能力,并且效果近似。


                使用FluidFM 技术测定共价键与非共价键之间的整合素受体RGD 之间的区别 a. FluidFM 测定粘附力的示意图; b. 细胞粘附力测定前后显微镜示意图; c.测定粘附力时候的力学曲线图;d. 最大粘附力图。

                 

                ■  Sancho 等通过FluidFM 技术使用了一种非常有趣的测量方法来测量MSX1 过表达对细胞骨架的影响。他们首先将10μm 的小胶球固定在探针上,之后使用探针去压细胞直到探针压力达到2 nN,通过压痕曲线来分析细胞骨架变化。通过对比发现过量表达MSX1 细胞的硬度显著比普通细胞高。如下图所示:


                使用FluidFM 技术测定HUAEC 中MSX1 过表达对细胞骨架的影响。a. HUAEC 细胞的免疫荧光染色phalloidin(上)、vimentin(下)(绿色)Hoechst(蓝色);b. HUAEC 细胞的免疫荧光染色phalloidin(红色)、vinculin(绿色)TOPRO-3(蓝色);c. 每个克隆中vinculin 阳性面积;d. 使用FluidFM 技术压细胞的示意图;e. 吸取10μm 珠子;f. 空白细胞下压时的力学谱线;g. MSX 过表达细胞下压时的力学谱线,更深的凹陷和平滑的斜率表示较低的刚度; h.用胶体压痕法测定细胞刚度的测量结果。

                 


                总结

                细胞粘附力测定在细胞生命科学研究中起着至关重要的作用,然而传统手段中有着各种各样的局限性,这主要原因是缺乏一种有效能够抓取细胞并进行力学测定的手段。现如今FluidFM 技术在细胞粘附力测定中的使用,使得研究者们有了一种能够有效、低损的方式抓取细胞,并配合着原子力显微镜的精确测量的特性,从而能够真正意义上的做到精准、无损、快速的测量单细胞粘附力,帮助研究者寻找细胞粘附力与细胞生命发展、肿瘤细胞转移之间的关系。


                参考文献: Y. Guo, F. Mei, Y. Huang, S. Ma, Y. Wei, X. Zhang, M. Xu, Y. He, B.C. Heng, L. Chen & X. Deng. Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis. (2021) Bioactive Materials.




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                单个Hela细胞的提取


                单个CHO细胞的注射


                单个Jurkat细胞的注射

                单细胞转染过程


                单细胞注射、提取


                ?  M. Li, L. Liu & T. Zambelli. FluidFM for single-cell biophysics. (2021). Nano Research. doi: 10.1007/s12274-021-3573-y FluidFM for single-cell biophysics (2021) Nano Research.

                ?  Y. Cui, X. Lyu, L. Ding, L. Ke, D. Yang, M. Pirouz, Y. Qi, J. Ong, G. Gao, P. Du & R.I. Gregory. Global miRNA dosage control of embryonic germ layer specification. (2021) Nature.

                ?  P. Saha, T. Duanis-Assaf & M. Reches. Fundamentals and Applications of FluidFM Technology in Single-Cell Studies. (2020) Advanced Materials Interfaces.



                单细胞分选

                 

                ?  M. Li, L. Liu & T. Zambelli. FluidFM for single-cell biophysics. (2021). Nano Research. doi: 10.1007/s12274-021-3573-y FluidFM for single-cell biophysics (2021) Nano Research.

                ?  W. Li, A. Sancho, W. Chung, Y. Vinik, J. Groll, Y. Zick, O. Medalia, A.D. Bershadsky & B. Geiger. Differential cellular responses to adhesive interactions with galectin-8- and fibronectin-coated substrates. (2021) Journal of Cell Science.

                ?  A. Garitano-Trojaola, A. Sancho, R. Goetz, P. Eiring, S. Walz, H. Jetani, J. Gil-Pulido, M. DaVia, E. Teufel, N. Rhodes, L. Haertle, E. Arellano-Viera, R. Tibes, A. Rosenwald, L. Rasche, M. Hudecek, M. Sauer, J. Groll, H. Einsele, S. Kraus & M. Kortüm. Actin cytoskeleton deregulaltion confers midostaurin resistance in FLT-3 mutant acute myeloid leukemia. (2021) Communications Biology.

                ?  N. Chala, S. Moimas, C. Giampietro, X. Zhang, T. Zambelli, V. Exarchos, T.Z. Nazari-Shafti, D. Poulikakos & A. Ferrari. Mechanical Fingerprint of Senescence in Endothelial Cells. (2021) Nano Letters.

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                ?  M. Mathelié-Guinlet, F. Viela, J. Dehullu, S. Filimova, J.M. Rauceo, P.N. Lipke & Y.F. Dufrêne. Single-cell fluidic force microscopy reveals stress-dependent molecular interactions in yeast mating. (2021) Commun Biol.

                 

                其他

                 

                ?  I. Demi, I. Lüchtefeld, C. Lemen, E. Dague, P. Guiraud, T. Zambelli & C. Formosa-Dague. Probing the interactions between air bubbles and (bio)interfaces at the nanoscale using FluidFM technology. (2021). Journal of Colloid and Interface Science.

                ?  C. Müller-Renno, D. Remmel, M. Braun, K. Boonrod, G. Krczal & C. Ziegler. Producing plant virus patterns with defined 2D structure. (2021). PSS Applications and materials science.

                ?  S. Wang, S. Liu, A. Sulkanen, J.M. Fox, X. Jia & G. Liu. Controlled Molecular Assembly of Tetrazine Derivatives on Surfaces. (2021). CCS Chem. (2021) CCS Chem.

                ?  A. Saftics, B. Türk, A. Sulyok, N. Nagy, T. Gerecsei, I. Szekacs, S. Kurunczi & R. Horvath. Biomimetic dextran-based hydrogel layers for cell micropatterning over large areas using the FluidFM BOT technology. (2019) Langmuir, ACS.Langmuir.8b03249.

                ?  J. Zhang, H. Yu, B. Harris, Y. Zheng, U. Celik, L. Na, R. Faller, X. Chen, D. R. Haudenschild, G. Liu. New Means to Control Molecular Assembly (2020) ACS Publications.


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